漫漫長路需求索 步步階梯到《科學》
——記在《科學》發(fā)表高水平論文的清華大學生命科學院2010級博士生鄧東
研通社記者 徐玲 時雪
圖為鄧東在做實驗。
醫(yī)學科學樓三層的墻壁上，粘貼著一篇篇清華大學結(jié)構(gòu)生物學中心發(fā)表的高水平學術(shù)論文，其中有一篇是最近發(fā)表于國際頂級學術(shù)期刊《科學》的文章，它的第一作者就是來自清華大學生命科學學院、PTN博士生項目的2010級博士生鄧東。師從清華大學醫(yī)學院顏寧教授，鄧東與閆創(chuàng)業(yè)、潘孝敬兩位同學用了不過半年的時間，在世界上首先解析出了TALE（Transcription Activator Like Effectors）蛋白——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白在有無DNA結(jié)合兩種狀態(tài)下的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，揭示了其特異識別DNA的分子機理。《科學》于2012年1月5日發(fā)表了他們的論文《Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors》（TALE蛋白特異性識別DNA的分子機制）。
之后幾個月，鄧東又以第一作者或者共同第一作者身份在Cell Research（細胞研究）和Cell Reports（細胞報告）期刊上分別發(fā)表了《Recognition of methylated DNA by TAL effectors》和《Specific DNA-RNA Hybrid Recognition by TAL Effectors》兩篇文章。
作為一名博士研究生，鄧東用自己出色的成績書寫著自己對于科研的熱愛。鄧東一直對生物抱有濃厚的興趣，在接受這個課題之前，他已在顏寧教授的實驗室工作了2年。當面對是去一家外國公司工作，還是在清華大學讀博時，他毅然決然地選擇了后者，因為他享受科研生活給自己帶來的樂趣。
TALE蛋白是生物技術(shù)領(lǐng)域里很重要的一類蛋白，早已得到廣泛地應(yīng)用。但是人們對它的工作機制即如何特異性識別DNA卻一無所知，這也限制了它擴大應(yīng)用范圍。鄧東之前一直從事的是對于膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學研究，但是在平時的論文閱讀中早就關(guān)注到了這一類神奇的DNA識別蛋白。所以當朱健康教授向顏寧教授提出合作研究dHax3這種TALE蛋白結(jié)構(gòu)的意向時，正中鄧東下懷。他正是想突破TALE結(jié)構(gòu)未知這一障礙，扛下了這個課題，他希望從結(jié)構(gòu)生物學的角度去研究它的工作機理。正如他所說：“這個問題就像病人吃藥一樣，如果不知道它如何發(fā)揮功效，勢必會出現(xiàn)問題。”
圖為鄧東在做實驗。
自此，鄧東和他的兩個同伴便在“研究TALE蛋白如何特異性識別DNA”這條道路上苦苦摸索，盡管從課題開始到取得成果只有短短的半年，但這其中的辛苦只有他們自己知道。從2011年3月他們接受課題，到10月15日成功解析出蛋白結(jié)構(gòu)，再到一鼓作氣地撰寫文章并于10月21日將文章投出，這背后的汗水、沮喪、欣喜、坦然，也只有他們自己才能深刻體會。
結(jié)構(gòu)生物學的研究主要分為幾大步驟，每一步都有各自的困難和失敗的可能。選擇了dHax3這個TALE蛋白，鄧東要面對的第一個難題就是得到大量的蛋白樣品。雖然在基因序列克隆上沒有遇到什么困難，但接下來的蛋白表達就碰上了大麻煩。他們經(jīng)過了大量的嘗試始終拿不到理想的蛋白，這意味著不能將實驗繼續(xù)進行下去。鄧東和同伴們也嘗試了其它幾種常規(guī)菌種，依舊沒有什么收獲。
就在這焦頭爛額之際，鄧東在翻閱文獻時偶然發(fā)現(xiàn)了一種菌種（Rosetta（DE3）），而實驗室恰巧有同學使用過。經(jīng)過新的試驗之后，效果出其意料的好，蛋白表達量特別高。“struggle（掙扎）了一個月一無所獲，而有一天你突然在網(wǎng)上或文獻里發(fā)現(xiàn)某種方法能使蛋白表達，那種感覺太棒了”，鄧東興奮之情溢于言表。
接下來面對的更大挑戰(zhàn)就是蛋白提純，蛋白雖然表達量很大，但是并不好純化。剛開始摸索的蛋白純化過程不但花費時間較長，而且蛋白的產(chǎn)率及純度都達不到實驗要求。為了得到高蛋白產(chǎn)率和純度，他們又進行了長時間的蛋白純化實驗的優(yōu)化。為了嘗試更多的條件和方法，他們經(jīng)常通宵達旦地在實驗室奮戰(zhàn)。功夫不負有心人，兩個多月過去了，他們不但能穩(wěn)定地拿到性質(zhì)很好的蛋白樣品，同時也拿到了TALE的第一顆蛋白晶體。“其實這個過程是存在風險的，一旦不成功，就意味著之前的工作功虧一簣，一切從頭開始。但這就是個實驗科學，你需要去做更多的嘗試才能得到自己所滿意的結(jié)果。我始終記得顏寧老師跟我說的‘you never know before you try it’（你在嘗試之前永遠不知道會是什么樣子）”，說到這兒，鄧東語重心長。
通過X射線對晶體進行衍射分析，經(jīng)過電腦對數(shù)據(jù)的處理，他們離得到TALE蛋白的結(jié)構(gòu)便只有咫尺之遙。然而，天將降大任于是人也，必先苦其心志，勞其筋骨。通向光明之路總是充滿荊棘，晶體的衍射分析數(shù)據(jù)并不理想。“很沮喪，我們廢了半天的勁還是得不到好的數(shù)據(jù)，又不知道其原因。衍射數(shù)據(jù)不好的話，我們就解不出其結(jié)構(gòu)”，鄧東焦慮地說。近一個月的糾結(jié)終結(jié)于鄧東和顏寧老師一次隨意的談話和他自己的勇敢嘗試，顏寧老師跟鄧東說，要么你試試脫水（一種優(yōu)化晶體的方法）, 鄧東迅速進行了實驗，所幸馬上就有了突破性的結(jié)果。嘗試之下發(fā)現(xiàn)，分辨率一下子提高了很多，從3埃提高到2埃（就像近視的人裸眼看東西和帶著眼鏡看東西的差別），TALE蛋白的結(jié)構(gòu)解析迎刃而解。說到這，鄧東補充道：“顏老師豐富的科研經(jīng)驗，對我的幫助相當大。她自己可能都沒有意識到的隨口而出的建議，給我們的實驗帶來了突破性的進展。”
然而，讓鄧東他們沒有想到的是實驗最艱辛的部分才剛剛開始。因為在對晶體進行衍射數(shù)據(jù)收集時，它的相位信息會發(fā)生丟失。他們必須解決相位問題，才能解析晶體結(jié)構(gòu)。在接下來兩個月的時間里，他們幾乎把所有能解決相位問題的方法都嘗試了一遍，收集了上百套的衍射數(shù)據(jù)進行分析，最終克服了這個困難。而在這期間，鄧東他們都要拎著沉淀淀的低溫保存罐把晶體帶到上海或者日本的同步輻射中心進行衍射數(shù)據(jù)的收集。他們?nèi)ツ抢锝?jīng)常得連續(xù)工作，比如今天早上8點開始工作，直到第二天早上8點才結(jié)束。拿到數(shù)據(jù)后回學校分析，數(shù)據(jù)不好則繼續(xù)準備晶體，下周繼而出遠門。那段艱辛又奔波的歲月，他至今記憶猶新。
TALE蛋白的結(jié)構(gòu)已經(jīng)拿到，剩下的就是分析它是如何特異性識別DNA的，這也是解密其生化功能的關(guān)鍵所在。經(jīng)過一番認真琢磨和分析，特別是在對蛋白質(zhì)和DNA研究方面具有二十年豐富研究經(jīng)驗的施一公教授的點撥下，鄧東和他的同伴終于突破重重阻礙揭開了TALE蛋白工作機制的神秘面紗。
“《科學》是在12月21日接收這篇文章的，過兩天剛好是我的生日，”鄧東說，這無疑是給他最好的生日禮物。
TALE蛋白特異性識別DNA的工作機制研究出來后，他們就把這個課題擱置不理了嗎？
NO！
接下來，他們反而更加細微地觀察TALE蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TALE上有能特異性識別含有5-甲基胞嘧啶修飾的基因。而5-甲基胞嘧啶是一種重要的DNA甲基化修飾，是表觀遺傳學研究的重點，他們首次將TALE和表觀遺傳學研究聯(lián)系起來。
此外，通過與博士后殷平合作，他們還發(fā)現(xiàn)TALE只與DNA雙螺旋的一條鏈結(jié)合。如果把另外一條不結(jié)合的鏈換成RNA或者其他雜鏈，是否會有同樣的結(jié)果。帶著這個疑問，他們又開始進行繁復(fù)的試驗。結(jié)果表明，TALE蛋白不但能識別雙鏈DNA，還能識別DNA-RNA雜合雙鏈。
這兩點發(fā)現(xiàn)也分別發(fā)表于Cell Research 和 Cell Reports 期刊上。
科研生活并非一帆風順，往往夾雜著很多的挫敗和曲折。這種時候鄧東會叫上實驗室的兄弟姐妹們?nèi)歌或者打打羽毛球來緩解壓力。“我的羽毛球打得不如林丹好，但是林丹提蛋白、長蛋白晶體肯定比不過我”，鄧東對于科研的熱愛和自信溢于言表，“我覺得科研能實現(xiàn)我的人生價值，我也想繼續(xù)做下去”。
科研之路漫漫，《科學》是成就也是新起點，鄧東的步步踏實將為他的未來帶來新的無限可能！
導(dǎo)師顏寧評語：寶劍鋒從磨礪出
我從事結(jié)構(gòu)生物學研究已經(jīng)有十多年，但是如此重要的一個課題由如此“年輕”的學生在如此短的時間內(nèi)完成，在我看來都算是一個奇跡，鄧東正是這個奇跡的創(chuàng)造者，而奇跡的背后是在之前幾年扎扎實實的積淀。與我諸多來自名校的直博生不同，鄧東在讀博之前先是在公司工作，然后在實驗室里做技術(shù)員。也許正是這些經(jīng)歷，使他與同年級的同學相比多了一份成熟與從容，更有一份經(jīng)過思考之后的堅定。作為一個導(dǎo)師，還有什么比看著學生創(chuàng)造奇跡更令人欣慰的呢？
