清華新聞網(wǎng)4月7日電 含硅有機(jī)物尤其是具有硅手性中心的化合物近年來在有機(jī)合成,、功能材料及藥物化學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值,，但其生物催化合成體系的發(fā)展仍顯著滯后于傳統(tǒng)化學(xué)方法。值得注意的是,，盡管硅元素在地殼中的豐度高達(dá)28.8%（以二氧化硅和硅酸鹽形式存在）,，但是生命系統(tǒng)對(duì)其生物利用卻極為有限，僅有硅藻等少數(shù)生物進(jìn)化出特異性硅代謝途徑,。研究如何利用酶催化過程制備或者轉(zhuǎn)化含硅化合物是合成化學(xué)以及生物催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,。近年來，相關(guān)領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展,，其中代表性的工作如利用細(xì)胞色素c催化卡賓的硅氫鍵插入反應(yīng),，以及利用細(xì)胞色素P450酶催化惰性硅氧烷添加劑中碳硅鍵氧化降解等。相關(guān)研究充分證明了酶工程在含硅化合物的制備以及轉(zhuǎn)化方面所具備的應(yīng)用潛力,，為發(fā)展綠色可持續(xù)的硅基材料合成技術(shù)開辟了新路徑,。
盡管如此，現(xiàn)有生物催化體系尚未見直接構(gòu)建硅手性中心的成功案例,。相關(guān)研究表明,，許多含硅有機(jī)物（如α-硅醇類結(jié)構(gòu)）在水溶液中穩(wěn)定性較低，容易發(fā)生分解及消旋化,。為了突破這一限制并填補(bǔ)領(lǐng)域空白,，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院劉臻課題組與浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院楊云芳團(tuán)隊(duì)合作，開發(fā)了基于P450氧化酶的去對(duì)稱化生物催化平臺(tái),。通過蛋白質(zhì)工程改造獲得的突變體,，其酶活較野生型提高了54倍，可在短時(shí)間內(nèi)完成硅烷底物的選擇性氧化,，從而有效規(guī)避產(chǎn)物分解與消旋化問題,。4月3日,，相關(guān)研究成員以“不對(duì)稱合成硅立體烷醇的酶促平臺(tái)”（An Enzymatic Platform for Asymmetric Synthesis of Si-Stereogenic Silanols）為題，發(fā)表于《德國應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）,。該研究利用源自Bacillus megaterium的野生型P450BM3酶為進(jìn)化起點(diǎn),，首次實(shí)現(xiàn)了含硅手性中心（Si-stereogeniccenter）硅醇的酶催化合成。研究人員通過六輪迭代式的定向進(jìn)化獲得了優(yōu)勢(shì)突變體ASOx-6,，其催化效率（kcat/KM）較野生型提升54倍,，可高效催化潛手性二氫硅烷的單氧化反應(yīng)，獲得相應(yīng)的手性硅醇產(chǎn)物,。該平臺(tái)兼容多種芳基-烷基取代底物（包括含芳雜環(huán)的硅烷）,，模版底物的總催化轉(zhuǎn)化數(shù)（TTN）可達(dá)1450。此外,，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬以及DFT計(jì)算的手段,，結(jié)合機(jī)理實(shí)驗(yàn)，研究人員系統(tǒng)闡明了該酶催化過程的反應(yīng)機(jī)制,。
圖1.手性硅醇的去對(duì)稱化合成策略
在研究的起始階段,，研究人員首先對(duì)于一系列碳?xì)滏I羥化酶的硅烷氧化活性進(jìn)行了篩選評(píng)估,。實(shí)驗(yàn)表明,，P450氧化酶對(duì)于這一目標(biāo)反應(yīng)不僅具有顯著的初始活性以及中等的手性選擇性，更為重要的是,，該催化體系中未檢測(cè)到二氫硅烷過度氧化的副產(chǎn)物硅烷二醇3a的生成,。基于這一發(fā)現(xiàn),，研究人員隨后利用野生型P450酶作為母體,，進(jìn)行了多輪的定向進(jìn)化。通過針對(duì)多個(gè)活性位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變（site-saturation mutagenesis）以及隨機(jī)突變（random mutagenesis）,，研究人員最終找到了催化這一反應(yīng)的高活性突變體ASOx-6,。在僅使用0.56‰酶載量的條件下，其催化模型底物的效果為81%的收率以及90%的ee值,。
圖2.關(guān)鍵酶的篩選與蛋白質(zhì)定向進(jìn)化
隨后,，研究人員對(duì)于該酶催化系統(tǒng)的底物適用性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估。實(shí)驗(yàn)表明,，多種芳基-烷基取代的二氫硅烷化合物可以被ASOx-6選擇性氧化,。底物的兼容性包括芳環(huán)上不同位置與電性的取代基，或者部分含有雜環(huán)的化合物,。針對(duì)部分中等收率或者較低選擇性的底物,，研究人員并未展開單獨(dú)的定向進(jìn)化，但指出基于蛋白質(zhì)工程經(jīng)驗(yàn),，可以通過類似的進(jìn)化策略獲得針對(duì)性的突變體,。
此外，放大反應(yīng)驗(yàn)證了該體系的合成潛力：分離的手性硅醇產(chǎn)物經(jīng)由鉑催化的硅氫化反應(yīng)，可立體專一性轉(zhuǎn)化為具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b,。
圖3.底物適用性拓展與合成應(yīng)用探索
通過DFT計(jì)算,，研究人員發(fā)現(xiàn)這一催化過程遵循與經(jīng)典碳?xì)滏I氧化體系相似的機(jī)制，包括氫原子攫?。℉ydrogen-atom abstraction）以及氧回彈（Oxygen-rebound）等關(guān)鍵反應(yīng)步驟,。計(jì)算及競(jìng)爭(zhēng)性KIE實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了氫原子攫取為反應(yīng)的產(chǎn)物決定步驟，然而由于硅氫鍵的鍵能顯著低于普通的碳?xì)滏I鍵能,，在這一硅烷氧化體系中,，該步驟并非反應(yīng)的決速步。分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)比顯示：野生型P450BM3與最終變體ASOx-6的近攻擊（near-attack）構(gòu)象中,，底物的pro-R氫原子均保持與鐵氧中間體較近的距離,，而關(guān)鍵突變使pro-S氫在突變體中與氧中心的平均距離增加。這一變化直接決定了最終變體對(duì)于該反應(yīng)更優(yōu)的對(duì)映選擇性,。
圖4.基于密度泛函理論（DFT）進(jìn)行的機(jī)理計(jì)算
總的來說,，定向進(jìn)化獲得的高效突變體ASOx-6是反應(yīng)成功的關(guān)鍵。通過開發(fā)這一硅烷不對(duì)稱氧化酶催化體系,，研究人員證明了不穩(wěn)定手性硅醇可以通過酶催化的手段獲得,，為含有硅手性中心化合物的合成提供了高效、環(huán)境友好且立體可控的生物合成策略,，有望在活性分子合成及硅基材料開發(fā)等領(lǐng)域獲得應(yīng)用,。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院研究員劉臻和浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院研究員楊云芳為論文通訊作者，劉臻課題組博士生代雙玉為論文第一作者,。該項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)部分主要由代雙玉完成,，計(jì)算部分主要由浙江工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院陳俠荷博士完成。研究得到科技部,、國家自然科學(xué)基金委,、浙江省屬高校基礎(chǔ)研究基金,、清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院,、浙江工業(yè)大學(xué)以及北京生命科學(xué)研究所的資助。
論文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202501524
供稿：生物醫(yī)學(xué)交叉研究院
編輯：李華山
審核：郭玲
