清華新聞網(wǎng)1月13日電 冷凍電子斷層成像（cryo-electron tomography,cryoET）技術,、冷凍聚焦離子束（cryo-focused ion beam,cryoFIB）樣品減薄技術和子斷層平均技術（sub-tomogram averaging,STA）的進步推動了生物大分子在細胞中的原位結(jié)構(gòu)測定,，對于研究膜蛋白結(jié)構(gòu)及其在細胞環(huán)境中的相互作用具有重要意義,。斷層掃描圖像（tomogram）是三維圖像，但由于低信噪比和細胞內(nèi)擁擠的環(huán)境,，當前的觀察方法仍主要依賴查看tomogram中的二維截面,。然而，細胞中的膜結(jié)構(gòu)通常呈彎曲形態(tài),，這使得通過二維截面難以直接觀察膜表面蛋白的分布,。同時，膜信號強烈的襯度也會干擾膜蛋白的識別,，增加原位觀察和結(jié)構(gòu)解析的難度,。
1月8日，清華大學生命學院李雪明副教授課題組在《自然·通訊》（Nature Communications）在線發(fā)表題為“MPicker：冷凍電子斷層成像中膜蛋白的可視化與挑選”（MPicker:visualizing and picking membrane proteins for cryo-electron tomography）的研究論文,。該論文報道了一種基于“膜展平”的方法,，通過在“展平tomogram”中進行操作來降低膜蛋白可視化與挑選的難度（圖1）。該方法首先通過膜分割或者手動標注定位感興趣區(qū)域（一片膜）,，然后在tomogram中對這片膜及其周圍的區(qū)域進行變形處理,，最終把這個局部區(qū)域展平為一個包含平整膜結(jié)構(gòu)的新tomogram，也就是展平tomogram,。在這個新生成的展平tomogram中,，原本彎曲的膜會變成一個平板，膜厚度與蛋白取向局部保持不變,。展平tomogram中每一層二維截面都對應一個平行于膜的等距面,，使得膜表面的蛋白信號可以輕易地以二維圖像的形式被展示。這起到了降維的效果,，降低了膜蛋白分析的空間復雜性,，改善了膜上和膜周圍蛋白質(zhì)的可視化效果。
圖1.MPicker軟件流程圖
基于膜展平方法,，研究團隊開發(fā)了名為MPicker的新軟件,，該軟件能夠在多種細胞切片樣品的tomogram中清晰展示膜表面的蛋白分布（圖2）。在展平tomogram中,，用戶可以更方便地識別并挑選顆粒,。為了提高自動化程度，MPicker還整合了EPicker軟件（一款原本用于單顆粒圖像的自動顆粒挑選工具）,，充分利用了展平tomogram二維化的優(yōu)勢,。除了在MPicker中進行操作，用戶也可以靈活地使用其他軟件在展平tomogram中進行顆粒挑選,。
圖2.使用MPicker對類囊體膜進行展平
MPicker還可以提供每個顆粒的初始取向用于輔助膜蛋白STA的計算,。除了常規(guī)的膜法向量,，用戶還可以方便地通過MPicker在展平tomogram中標注蛋白在膜表面的面內(nèi)取向,，從而利用更強的角度約束來輔助STA的計算,。為提高取向確定的自動化程度，研究團隊將膜蛋白沿膜法向量投影,，并進行了改造的二維分類,，從而更高效地獲得每個顆粒的精準取向信息。通過這一方法,，團隊使用四套tomogram數(shù)據(jù)成功解析了衣藻PSII-LHCII超復合物的低分辨原位結(jié)構(gòu)（圖3）,，并將結(jié)果上傳至EMDB數(shù)據(jù)庫（EMD-61019）。
圖3.通過膜蛋白的法向量和面內(nèi)角約束STA的計算
生命學院李雪明副教授為論文的通訊作者,，生命學院2020級博士生顏嘯峰為論文的第一作者,。電子系李樹東、黃煒琳,，生命學院王皓博士（已畢業(yè)）,，電子系趙天放、黃銘濤,，冷凍電鏡平臺周昵昀博士,，以及電子系沈淵教授為本研究作出了重要貢獻。研究得到國家自然科學基金委,、生命科學聯(lián)合中心,、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心等的資金支持，并得到國家蛋白質(zhì)科學研究（北京）設施清華基地的技術支持,。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-55767-w
軟件鏈接：
https://thuem.net/software/mpicker/overview.html
供稿：生命學院
編輯：李華山
審核：郭玲
